Caracterização de resistomas de antibióticos por bacteriófago reprogramado

Nature Microbiology volume 8, páginas 410–423 (2023) Citar este artigo

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A metagenômica funcional é uma ferramenta experimental poderosa para identificar genes de resistência a antibióticos (ARGs) no ambiente, mas a variedade de espécies bacterianas hospedeiras adequadas é limitada. Essa limitação afeta tanto o escopo dos ARGs identificados quanto a interpretação de sua relevância clínica. Aqui apresentamos um pipeline de metagenômica funcional chamado Reprogrammed Bacteriophage Particle Assisted Multi-species Functional Metagenômica (DEEPMINE). Esta abordagem combina e melhora o uso do bacteriófago T7 com fibras de cauda trocadas e mutagênese direcionada para expandir a especificidade do hospedeiro do fago e a eficiência da metagenômica funcional. Essas partículas de fago modificadas foram usadas para introduzir grandes bibliotecas de plasmídeos metagenômicos em patógenos bacterianos clinicamente relevantes. Ao rastrear ARGs em microbiomas do solo e do intestino e genomas clínicos contra 13 antibióticos, demonstramos que essa abordagem expande substancialmente a lista de ARGs identificados. Muitos ARGs têm efeitos específicos da espécie na resistência; eles fornecem um alto nível de resistência em uma espécie bacteriana, mas produzem uma resistência muito limitada em uma espécie relacionada. Finalmente, identificamos ARGs móveis contra antibióticos que estão atualmente em desenvolvimento clínico ou foram recentemente aprovados. No geral, o DEEPMINE expande a caixa de ferramentas de metagenômica funcional para estudar comunidades microbianas.

A metagenômica permite a análise exaustiva de comunidades microbianas, incluindo espécies que não podem ser cultivadas em condições de laboratório. Ao extrair dados genômicos de amostras ambientais, os pesquisadores obtêm conhecimento sobre as composições das espécies e a funcionalidade do microbioma em uma variedade de ambientes naturais1. Em particular, a metagenômica funcional é dedicada à triagem do DNA metagenômico quanto à presença de genes que codificam funções moleculares específicas2,3,4. A clonagem e a expressão de DNA metagenómico fragmentado num hospedeiro bacteriano podem revelar proteínas anteriormente não descritas. As aplicações da metagenômica funcional incluem a identificação de enzimas, exploração de agentes bioativos e triagem de genes de resistência a antibióticos residentes no ambiente5,6,7,8. As bibliotecas normalmente contêm milhões de fragmentos de DNA, correspondendo a uma cobertura total de 5 a 100 Gb, o tamanho de milhares de genomas bacterianos7,9,10.

Embora a metagenômica funcional possa ser potencialmente útil para diversas áreas de pesquisa, em sua forma atual a metodologia está longe de ser perfeita, limitando sua aplicabilidade. Dado o enorme tamanho das bibliotecas de plasmídeos, a introdução eficiente dessas bibliotecas em um hospedeiro bacteriano é de importância central. No entanto, este processo - normalmente por eletroporação, conjugação ou transdução de bacteriófago convencional - é complicado e só é eficiente para uma gama limitada de cepas de laboratório11,12. Essa limitação tem consequências de longo alcance na aplicabilidade de telas metagenômicas funcionais e na generalidade das conclusões que podem ser tiradas13,14. Por exemplo, dificulta a triagem de genes biotecnologicamente ou clinicamente relevantes que são funcionais apenas em espécies bacterianas específicas 12,15,16. Em particular, a maioria das telas metagenômicas para genes de resistência a antibióticos (ARGs) dependem fortemente do uso de cepas laboratoriais de Escherichia coli como hospedeiros bacterianos5,17,18. Portanto, os ARGs que não fornecem resistência nessas cepas, mas o fazem em outros patógenos clinicamente relevantes, permanecem indetectáveis. De fato, estudos anteriores indicam que o impacto das mutações de resistência a antibióticos nos fenótipos de resistência depende do histórico genético do hospedeiro bacteriano19. Além disso, telas metagenômicas em várias bactérias hospedeiras podem fornecer informações valiosas sobre compatibilidade funcional interespécies e mobilidade de ARGs20.

Neste artigo, apresentamos a metagenômica funcional multiespécie assistida por partículas bacteriófagas reprogramadas (DEEPMINE), que fornece uma solução para esses problemas (Fig. 1a). O DEEPMINE é baseado em um trabalho anterior que visava estender a gama de hospedeiros de partículas de fago T7 para transdução de DNA por meio da troca de caudas entre diferentes tipos de bacteriófagos21. O DEEPMINE emprega tais partículas de transdução de bacteriófagos modificados para fornecer grandes bibliotecas de plasmídeos metagenômicas a uma variedade de espécies bacterianas. Além disso, aplicamos a evolução laboratorial direcionada para aumentar a eficiência dessa entrega da biblioteca22. Usando essa abordagem, realizamos telas metagenômicas em patógenos bacterianos clinicamente relevantes da família Enterobacteriaceae. Identificamos vários ARGs não relatados anteriormente com efeitos específicos da espécie na suscetibilidade a antibióticos. Além disso, estudamos um conjunto de antibióticos que foram aprovados recentemente para uso clínico ou estão em estágio avançado de desenvolvimento clínico e mostramos que esses novos antibióticos são tão propensos à formação de resistência quanto os antibióticos antigos após décadas de uso clínico (Dados Estendidos Tabela 1).